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當靜脈注射時，各種顆粒和納米藥物會激活補體，可能導致輸液反應和其他藥物不良反應。顆粒在治療蛋白的配方中，由于運輸、處理和給病人的治療過程中產生的應力形成。在本研究中，IVIg溶液被儲存在多種類型的小瓶和預填充的注射器中，并暴露在攪拌和凍融應力下產生顆粒。將應激樣本加入人血清中，以確定這些顆粒是否激活補體。大小在2到10微米的亞可見IVIg顆粒其激活補體的方式與顆粒數量呈現出線性關系，而在較大粒子(>10微米)的劑量和補體激活之間幾乎沒有相關性。通過亞可見顆粒IVIg激活補體是另一種途徑，如補體級聯因子Bb的釋放和無C4a生成的過敏性毒素C3a和C5a。亞可見顆粒的數量和形態取決于所施加的應力、配方和容器材料。但2- 10微米大小的微粒激活人血清補體的能力僅取決于微粒濃度。

介紹

治療性蛋白質為多種人類疾病提供有效的治療。然而，在小部分患者中，這些藥物的安全性和有效性受到不良藥物反應(ADRs)的影響，包括不良免疫反應、輸液反應、過敏反應，甚至死亡。有些ADR很常見。例如，在大約一半的第一次接觸利妥昔單抗的b細胞惡性腫瘤的患者的過敏反應中，14.5%的患者報告有嚴重的輸液反應，12.3%的患者對anti-TNF-a抗體英夫利昔單抗有輸液反應。過敏反應，超敏反應和增加(不希望的)抗體反應都可由補體激活引起。補體通常作為一種對抗病毒和微生物挑戰的生物防御機制被激活，但是靜脈給藥的納米顆粒也可以激活補體級聯。一旦補體級聯被激活，就會產生強烈的促炎和過敏性反應。這些反應的強度主要是由補體系統中產生的2種過敏性蛋白C3a和C5a的程度所驅動的。這兩種信號分子能夠引起血管擴張，調節細胞因子的產生，引起組胺的釋放和氧化爆發，并作為天然免疫細胞趨化的信號。

治療性蛋白在生產、運輸、儲存和給患者使用過程中容易聚集形成可溶性低聚體和亞可見顆粒。這些聚集物是不良免疫反應的危險因素，可導致治療效果的喪失和其他不良反應。蛋白質的聚集通常是由蛋白質暴露的界面相互作用引起的，例如空氣-水、容器-水和冰水界面。這些界面應力可以通過處理放大。例如，在硅油潤滑的注射器中發現的容器水界面上的蛋白質的聚集可以通過攪拌大大加速，而治療性蛋白質配方中的顆粒水平可以通過凍融顯著增加。我們假設，像一些納米藥物一樣，蛋白質配方處理產生的顆粒可能能夠激活補體。為了驗證這一假設，我們首先進行了加速穩定性實驗，通過使多克隆抗體配方(靜脈免疫球蛋白，IVIg)在多種類型的小瓶中受到冷凍或在多種類型的預填充注射器中受到攪拌引起的壓力，在多克隆抗體配方中產生顆粒。然后，我們測試了這些處理誘導的顆粒添加到人類血清樣本中是否能夠激活補體。使用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定補體激活程度，以量化補體促炎特性的2個關鍵信號分子C3a和C5a的水平。此外，我們測定了C4a和Bb的水平，以探索哪些補體通路可能被激活。C4a的產生是補體通過經典或凝集素途徑激活的標志，而Bb的產生則表明補體通過其它途徑激活。

材料與方法

使用的材料是USP級或更高。靜脈注射免疫球蛋白(丙種球蛋白;GAMMAGARD LIQUID?，Shire US Inc.， Lexington, MA)是從科羅拉多大學博爾德分校的Wardenburg藥房購買的。購自Sigma Aldrich公司(St. Louis, MO)的化學品包括磷酸一鈉、磷酸二鈉和甘氨酸。從Fisher Scientific(Waltham，MA)購買的化學品包括聚山梨酯20 (PS20, Tween 20?，N.F.)10倍磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和HyClone?注射水。硅化玻璃注射器為BD催眠SCF 1 mL長27G1/2 (BD Medical-Pharmaceutical Systems, Franklin Lakes, NJ)。SiOPlas?注射器(1ml) (SiO2 Medical Products, Inc.， Auburn, AL)由環烯烴聚合物(COP)注射器筒組成，其內部表面涂有硅基屏障涂層系統和有機硅潤滑油，均采用等離子體增強化學氣相沉積技術。SiOPlas?小瓶(6ml)由COP組成，在小瓶內部涂覆硅基屏障涂層系統。6 mL Ompi EZ-fill?硼硅玻璃小瓶(Schott, AG)由SiO2 Medical Products, Inc. (Auburn, AL)提供。

蛋白配方

使用前，IVIg的蛋白濃度為1 mg/mL，用pH 7.4的PBS配制，或用pH 4.25的250mm甘氨酸配制，即0.02% (v/v) PS20配制。為了去除任何已存在的顆粒，將含有100 mg/mL免疫球蛋白G在250 mM甘氨酸中的GAMMAGARD LIQUID?樣品，在4°C, 20000 G離心20分鐘，上清液作為儲存液。將IVIg原液用0.02% (v/v)的PS20稀釋1:100至0.22微米過濾的PBS pH 7.4或250 mM甘氨酸pH 4.25，得到最終濃度為1 mg/mL的IVIg。

對IVIg配方進行攪拌加速應力試驗

將IVIg配置至0.02% (v/v) PS20與pH 4.25，250 mM甘氨酸溶液中。填充入注射器，使液體和塞子之間有一個均勻的4毫米的空隙(達維勒制藥包裝公司，Pennsauken, NJ)。這些注射器在室溫下從頭到尾旋轉10天，每旋轉一次，頂空間隙中的氣泡就會從注射器的一端移動到另一端。在一些被測試的注射器中，氣泡會卡在注射器的一端，并且隨著注射器的旋轉而無法移動。這些注射器被排除在外，不參與分析。經過10天的端到端旋轉后，使用自動注射泵以150mm /min的速度從注射器中通過針頭排出每種制劑，并在預先準備的聚丙烯管中收集樣品，檢測亞可見顆粒濃度和補體活化能力。

將PBS中填充1mg /mL IVIg的樣品注入到另一組硅化玻璃和SiOPlas?注射器。這些注射器被水平放置在軌道搖床上，在室溫下搖一夜。搖動后，使用自動注射泵以150mm /min的速度將配方液從注射器中通過針頭排出，收集在預浸的聚丙烯管中，并檢測亞可見顆粒濃度和補體活化能力。

IVIg凍融制劑的加速應力試驗

用含1mg /mL IVIg的4ml配方填充硼硅酸鹽瓶(6ml)和SiOPlas?瓶(6ml)， PBS pH 7.4。小瓶的內容物經過1或6次凍融循環。在每個凍融循環中，小瓶先在液氮中浸泡2 min，然后在30_C水浴中解凍14.5 min，輕輕旋轉攪拌后再進行下一個凍融循環。

亞可見粒子濃度分析

如前所述，使用流式成像顆粒分析儀(FlowCAM?，Fluid imaging Technologies, Scarborough, ME)獲取不同強調配方中的顆粒濃度和顆粒圖像。經過6次凍融循環的樣品中顆粒濃度接近或超過流動成像顯微鏡儀器的上限，因此在分析前用pH 7.4的PBS稀釋100倍。在強調的配方中，顆粒計數被測量在相同的單個注射器和小瓶被測試補體激活的樣本中。每個樣品都有一個顆粒大小分布；在測試強化配方激活補體的能力之前，盡量不讓顆粒分形。

表1

進行補體激活試驗的受應力樣品中亞可見顆粒的濃度

從每個應力/容器組合中收集3個樣品。容器與容器之間的顆粒濃度差別<15%。

可溶性蛋白組分的排阻色譜分析

排阻色譜被用來監測單體蛋白的保留和在應用攪拌或凍融應力后IVIg樣品中任何可溶性聚集物的外觀。TSKgel G3000SWXL柱(TOSOH Biosciences, montgomery yville PA)與Agilent 1100系列柱(Santa Clara, CA)一起使用。洗脫液在安捷倫化學站軟件中以280 nm的吸光度進行監測。流動相為100mm硫酸鈉、100mm磷酸鈉和pH為6.7的0.05% (w/v)疊氮化鈉，以0.6 mL/ min的速度通過系統。色譜圖中的峰面積用GRAMS/AI version 9.1 (Thermo Fisher Scientific Inc.， Waltham, MA)進行量化。在應用加速應力條件后，從(本質上)無顆粒、離心和過濾的起始配方的可溶性蛋白的部分損失被量化使用峰面積的比率為應力和非應力配方。

人類血清樣本中的補體激活

從3個小瓶或注射器中收集的不同應激IVIg制劑的樣品以及每種制劑的非應激對照樣品被送往Exsera BioLabs (Denver, CO)，以分析它們激活補體的能力。補體激活在3個個體獻血者的正常血清池中進行了測量，這些獻血者之前曾篩查過補體功能正常。將脅迫的IVIg制劑的試驗樣品稀釋10倍到混合的人血清中，混合后在37°C孵育30分鐘。孵育后，樣品在80°C保存，直到進行進一步的測試。為了分析補體的活化，使用從Quidel公司(San Diego, CA)購買的試劑盒，采用ELISA法測定了四種補體級聯活化片段C3a、Bb、C4a和C5a的濃度。選擇C4a是因為它是經典或凝集素通路激活的標志，Bb是補體激活備選通路的明顯標志，C3a是補體激活的中心點，C5a是補體通路終端激活的標志。對四種補體級聯蛋白分別進行了40次3遍重復ELISA檢測。除了測試應激IVIg樣本，還分析了幾個對照。這些對照樣品僅包含混合血清或血清樣品，其中以1:9的比例加入含zymosan的生理鹽水PBS或含熱聚集伽馬球蛋白的PBS。測量的平均值與顆粒樣本計數相比，在鹽水對照中測量的濃度增加了一倍。

結果

IVIg配方的加速應力測試中顆粒的形成

正如預期的那樣，每種加速應力測試方法都會在測試配方中產生微顆粒(表1)。在pH 7.4的PBS條件下，IVIg的凍融產生的亞可見顆粒最多。在硼硅酸鹽和SiOPlas?瓶中，一次凍融循環分別產生3.2?105和7.1?105個粒徑大于2微米的顆粒。也生產了大于10微米的顆粒，在硼硅酸鹽瓶中檢測到8.0?104個顆粒，在SiOPlas?瓶中檢測到5.1?104個顆粒。

多次凍融循環使顆粒數進一步增加了約一個數量級(表1)。6次循環后，硼硅酸鹽瓶和SiOPlas?瓶中的顆粒濃度分別增加到：大于2微米的4.8?106和2.1?106個顆粒/mL。也生成了大于10微米的顆粒，分別在硼硅酸鹽瓶和SiOPlas?瓶中生成2.3?105和3.6 ?105個顆粒。

由于攪拌應力而產生的顆粒數量取決于容器類型和所應用的攪拌類型。使用定軌搖床pH值7.4 PBS中的IVIg配方進行晝夜不間斷攪拌，在硅化玻璃注射器中產生了大于2微米的顆粒濃度6.0?105個/毫升，以及在SiOPlas?注射器中產生了2.4?106個顆粒 /毫升，如 (表1)。與凍融研究一樣，兩種類型的注射器形成大顆粒(> 10微米) 的差別約一個數量級。

在“端到端”旋轉10天的加速穩定性試驗中。pH為4.25甘氨酸IVIg制劑在硅化玻璃注射器和SiOPlas?注射器中分別檢測到粒徑大于2微米的1.0?105和3?103顆粒/mL。相應的，大于10微米的顆粒也較少，在硅化玻璃和SiOPlas?注射器中分別檢測到2.0? 103和90個顆粒/mL。

圖1展示了由各種加速應力方法產生的典型的由流式顆粒成像分析儀（FlowCam）所捕捉到的顆粒圖像。在小瓶中，凍融應力下的樣品主要含有具有蛋白質聚集物特征的非球形微粒，硅化玻璃注射器中攪拌應力下的樣品包含大量球形顆粒，這是滴潤滑劑顆粒的特點(圖1 a、c、e和f)。在SiOPlas?注射器中，攪拌應力作用下產生顆粒具備形狀不規則蛋白質聚體和球形硅油液滴(圖1 b和d)。

對于所有的加速應力條件測試，尺寸排除色譜分析顯示，只有<5%的不溶性蛋白形成。在任何條件下均未檢測到可溶性聚集物。在硼硅玻璃小瓶中，6次凍融循環使IVIg產生的顆粒濃度最高，達到大于2微米顆粒500萬個/毫升，但這僅表示損失了3.7%的原始單體蛋白。

在加速應激條件下產生的顆粒對人血清中的補體激活

當IVIg配方被稀釋10倍于人血清時，在加速應激條件下，IVIg配方中大于2微米的顆粒與激活補體呈線性關系(圖2-4)。在大于10微米顆粒數量較多的樣本中，補體激活水平通常較高，但這些較大顆粒的水平較低，不能明確的劑量的相關性見圖5。

觀察到的補體激活與通過替代途徑的激活一致。沒有增加C4a鹽水控制水平,這是一個典型的標志或凝集素途徑(圖6)。相比之下,Bb,補體激活的標記的替代途徑,增加線性(r2=0.94)的濃度大于2微米粒子尺寸范圍的增加(圖2)。

增加過敏毒素的濃度C3a Ca5也觀察到當粒子被稀釋到血清(圖3和4)。與Bb響應,褶皺增加與鹽水控制線性依賴于粒子的劑量,與相關系數r2 C3a和ca5的0.85和0.99,分別。對IVIg配方的反應，在硼硅酸鹽玻璃小瓶中經過6次凍融循環后，C3a和C5a的濃度增加了2.4- 8.9倍，比在生理鹽水對照組中觀察到的要高。

作為比較，含有1 mg/mL zymosan或1 mg/L熱聚集伽馬球蛋白的陽性對照可刺激C3a、Bb和C4a約11倍(與生理鹽水相比)，C5a水平約32倍(與生理鹽水相比)。

圖1所示。使用流式顆粒成像分析儀（FlowCam）對不同應力條件下IVIg樣品進行檢測。這些圖片是在眾多顆粒圖片中隨機選取的：(a)在定軌搖床上經過隔夜攪拌，玻璃注射器中的IVIg樣品；(b)使用用SiOPlas?注射器在定軌搖床上攪拌的樣品；(c)硅油潤滑玻璃注射器的端到端旋轉10天；(d) SiOPlas?注射器的端到端旋轉10天；(e)玻璃瓶內凍融6次；(f) SiOPlas?瓶中凍融6次。

圖2。樣品顆粒水平對人體血清樣品Bb濃度的影響。在生理鹽水對照樣品中，隨著倍數的增加，濃度被報告為Bb水平。顆粒濃度是指IVIg制劑在稀釋10倍于人血清之前的濃度。直線表示最小二乘線性擬合，相關系數為r2=0.94。

圖3。樣品顆粒水平對人體血清中C3a濃度的影響。在生理鹽水對照樣品中，濃度隨著濃度的增加而增加。顆粒濃度是指IVIg制劑在稀釋10倍于人血清之前的濃度。直線表示最小二乘線性擬合，相關系數為r2=0.85。

圖4。樣品顆粒水平對人體血清中C5a濃度的影響。據報道，在生理鹽水對照樣品中，fold相對于C5a水平升高。顆粒濃度是指IVIg制劑在稀釋10倍于人血清之前的濃度。直線表示最小二乘線性擬合，相關系數為r2=0.99。

圖5。10微米以上顆粒濃度對人血清樣品中C5a(填充圓)和C3a(開放圓)濃度的影響據報道，在生理鹽水對照樣品中，濃度隨C5a和C3a水平的增加而增加。顆粒濃度是指IVIg制劑在稀釋10倍于人血清之前的濃度。直線表示最小二乘線性擬合，C5a和C3a相關系數分別為r2=0.60和r2= 0.47。

圖6。IVIg樣本中的蛋白顆粒沒有刺激C4a濃度在人血清樣本中的釋放。據實驗結果，在生理鹽水對照樣品中，fold與C4a水平相比濃度增加了。顆粒濃度是指IVIg制劑在稀釋10倍于人血清之前的濃度。直線表示最小二乘線性擬合，相關系數為r2=0.005。

討論

亞可見顆粒普遍存在于治療性蛋白質的配方中，但在運輸、處理和儲存過程中遇到的應力變化會大大增加它們的水平。在運輸和液體的日常處理過程中，由于振動引起的攪動壓力。盡管治療蛋白的液體配方通常在受控溫度下保持液態，但意外凍結可能發生，特別是用凝膠包冷卻的容器中，或在用于家庭管理的配方中，冷凍會在運輸過程中發生。在這里測試的多克隆抗體配方中，當預先填充的注射器中的IVIg配方受到攪拌時，或當配方在小瓶中被凍融時，可以看到顆粒水平的增加。目前研究旨在調查蛋白配方中的亞可見顆粒是否提高補體激活的能力，所以我們使用了各種配方和加速壓力條件下創建樣本顆粒的大小和濃度,但我們沒有試圖闡明每個應力的詳細機制促進粒子的形成。

凍融試驗后觀察到的顆粒濃度取決于藥瓶類型和配方所受凍融循環次數。經過6次凍融循環，每mL樣品可產生數百萬個大于2mm的顆粒，數十萬個大于10mm的顆粒。有趣的是，在玻璃瓶中經過多次凍融循環的樣品比在聚合物SiOPlas?瓶中冷凍的樣品產生了更多的顆粒。我們推測，與那些在更靈活的循環聚烯烴瓶中所經歷的相比，玻璃瓶中更多的顆粒是由于冰在剛性玻璃瓶中膨脹時產生了更高的機械應力造成的。

注射器中IVIg配方的攪動所產生的顆粒數取決于所施加的攪動應力的強度、緩沖條件和注射器類型。在平板搖床上進行高強度通宵攪拌所產生的顆粒比低強度、端到端旋轉10天所產生的顆粒要多。攪拌硅油潤滑的預填充注射器會產生硅油液滴特征的球形顆粒，以及少量非球面的、近乎半透明的典型蛋白質聚集顆粒，這些顆粒看起來是由硅油液滴和聚集的蛋白質組成的。SiOPlas?注射器中產生的顆粒較少，其中等離子體化潤滑層比液態硅油潤滑層更不容易被流體剪切和界面張力從表面去除。

補體活化是一種不良反應，與許多納米藥物中的納米顆粒存在有關。雖然許多類型的納米顆粒已被證明可以激活補體，但也有其他納米顆粒表現出最小程度的補體激活。納米顆粒誘導的補體活化可通過經典途徑、凝集素途徑或其他途徑發生。通過經典途徑激活補體是抗原結合的IgG激活的一個特征。當與抗原結合的Igg的Fc區域組裝形成六聚體復合物時，就會發生這種激活。相比之下，在本例中，Bb水平的增加對IVIg配方中的顆粒的響應表明補體是通過另一種途徑激活的，可能是通過非特異性結合，不同于Fc介導的天然IgG功能的激活特征。蛋白質顆粒通過替代途徑誘導補體活化的結構基礎尚不完全清楚，但對于其他納米顆粒，替代途徑活化是補體級聯蛋白C3非共價沉積在顆粒表面所致。

在IVIg配方中，補體對操作誘導顆粒的激活是很強的。即使在我們測試的產生最多微粒的凍融條件下，大多數蛋白質仍以單體形式可溶。例如，在玻璃瓶中經過6次凍融循環后，根據HPLC分析的單體損失，只有3.7%的原1 mg/mL的單體蛋白聚集在37微克/mL的顆粒上。然而，這少量的集合體引發了Bb、C3a和C5a的釋放，其釋放水平大約是1 mg/mL陽性對照酵母聚糖和熱聚集伽馬球蛋白釋放水平的四分之一。

應用于玻璃和SiOPlas?容器中的IVIg配方的凍融和攪拌應力產生了跨越幾個數量級的顆粒數，通過流式顆粒成像分析儀（FlowCam）分析顆粒時，觀察到不同的特征形態。然而，當在一個檢查全面顆粒的基礎上，顆粒激活補體的傾向不取決于顆粒的形態。值得注意的是，流動成像顯微鏡對具有微米級特征的顆粒形態特征很敏感。有可能在更精細的尺度上，不同顆粒類型中的蛋白質結構可能是相似的，因此每個顆粒的補體活化水平相似。

表面活性劑的微粒如PS20和聚山梨酯80已被證明能夠激活補體。但在本例中，補體激活似乎并不強烈依賴于表面活性劑的濃度，因為添加PS20和不添加PS20的劑型之間顆粒劑量依賴性是無法區分的。

我們觀察到的補體激活與小于10微米的顆粒濃度呈線性相關性。補體的激活也普遍存在于大顆粒（大于10微米）數量最高的樣本中 (見圖5)，這些較大的顆粒在不同應力條件下的IVIg樣品中被發現，但是其濃度比較小顆粒的2- 10微米大小的顆粒的相應濃度低大約一個數量級。因此，對于補體的激活是否依賴于大于10微米的顆粒，我們的實驗并不能確定。有趣的是，更小的亞微米顆粒目前還沒有在腸外給藥的蛋白質產品有明確規定‘；國藥典< USP 787/788 >中描述的顆粒含量限制僅適用于大于10微米和大于25微米的顆粒。監測小于10微米的顆粒，可以洞察治療蛋白制劑的潛在免疫原性和補體激活能力。

在將這些結果擴展到預測補體激活引起的藥物不良反應時，應謹慎使用。由于遺傳和后天因素的影響，補體激活的閾值和程度可能因患者而異，從而直接預測顆粒在體內的反應是有問題的。此外，體外試驗中使用的無細胞血清可能低估了顆粒激活補體的能力;在全血中，B細胞的存在增加了患者對利妥昔單抗激活補體的敏感性。最后，納米顆粒對補體的激活可能具有高度的物質特異性，并且由其他蛋白藥物形成的顆粒，例如單克隆抗體，可能與IVIg中存在的多克隆抗體混合物中的顆粒行為不相似。

結論

我們觀察到，在基于血清的體外試驗中， IVIg制劑產生一次意外凍融就能產生足夠數量的顆粒來激活補體。對于受應力樣品中2- 10微米大小的顆粒，補體激活與顆粒濃度成正比，而對于相同樣品中>10微米的顆粒，則沒有觀察到明顯的關聯性。活化補體的水平與多種應力產生的特定顆粒形態無相關性，也與配方中非離子表面活性劑的存在無相關性。雖然這些結果可能不是很容易對病人注射了其他單克隆抗體藥物產品后產生的藥物不良反應進行定量預測，明智的做法顯然是采取措施來規范處理,存儲和管理治療蛋白質產品以減少顆粒物產生。重要的是需要監測10微米以下大小的微粒來洞察免疫原性。