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基因治療是生物制藥行業中一個快速增長的領域，通過基因治療可實現疾病的治療或預防。其中，重組腺相關病毒(rAAV)是目前基因治療領域研究較多的一類病毒載體。
腺相關病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成員之一，一般，研究中采用的重組腺相關病毒載體（Recombination adeno-associated virus, rAAV）是在非致病的野生型AAV基礎上改造而成的基因載體，由于其種類多樣、免疫原性極低、安全性高、宿主細胞范圍廣、擴散能力強、體內表達基因時間長等，rAAV被視為最有前途的基因研究和基因治療載體之一。
目前，rAAV的準確定量分析和表征的難度是阻礙基因治療快速發展的關鍵因素。我們常常需要對rAAV進行綜合全面表征，比如衣殼數量、實心率、顆粒尺寸、聚集體比例等。傳統情況，rAAV滴度和病毒載量采用ELISA、ddPCR、AUC和EM等技術進行測量。但這些方法通常費時費力，而且精確度不高。
本文通過GPC/SEC和多角度動態光散射（MADLS）兩種分析技術分析rAAV5樣品，展示了快速、準確和可靠地定量測量AAV的病毒滴度（AAV Titer）和實心率(% full AAV)的方法。
 
01儀器參數
OMNISEC GPC/SEC多檢測器系統非常適合于生物醫藥行業，可用于全面表征rAAV樣品。OMNISEC包含一個示差折光檢測器(RI)，紫外線全波長陣列檢測器(UV-Vis 190-900 nm)和光散射檢測器，僅需一次進樣，可精確測量絕對分子量、聚集體比例、病毒滴度和實心率。
與傳統HPLC不同，測量過程不依賴柱保留體積，也不需要一系列標樣進行色譜柱校正。圖1顯示了使用OMNISEC測量的CQA關鍵質量參數。

02檢測方法
我們采用Empty和Full rAAV5兩個樣品作為分析案例。Full rAAV5 載有已知分子量為785 kg/mol的PFB-GFP ssDNA。經qPCR和ELISA測量方式可知，該樣本的病毒滴度為2.5x10¹³。
采用色譜柱P4000和P3000串聯，對rAAV樣品的進行色譜分離。由OMNISEC軟件采集分析測試結果，其中硬件系統包含OMNISEC RESOLVE(包含泵、自動進樣器和柱溫箱)和OMNISEC REVEAL（包含示差、UV/PDA和直角90°/小角7°光散射檢測器）。

樣品經過分離洗脫后，使用共聚物分析方法確定樣品兩種不同組分的濃度和分子量。計算方法如下：

其中，Conc_Capsid是衣殼濃度(mg/mL)，NA是阿伏伽德羅數，Mw_capsid是衣殼的分子量(g/mol)，Conc_DNA是DNA濃度(mg/mL)，MwSeq_DNA是來自序列的ssDNA的分子量。因此，通過計算出的顆粒濃度，可以很容易地得出樣品實心率的百分比。
 
03檢測結果
案例一：
圖2顯示了Empty rAAV5的三檢測色譜圖。RI信號由紅色曲線表示，260 nm紫外信號由紫色曲線表示，直角光散射(RALS)信號由綠色曲線表示。樣品包含四個部分：單體峰保留體積(RV)在12.5ml，碎片在16ml ，二聚體在10.5ml ，聚集體在8.5ml 。使用共聚物分析方法，可以得到表1結果。

單體的分子量為3.84×10⁶g/mol。衣殼的理論分子量為3.8×10⁶g/mol，證實分析結果與預期相符。
M_W/M_n為分子量分布，描述了樣品的分散性，單體和二聚體的值接近1，而聚集體和片段均顯著高于1，表明在同一峰內有多個不同分子量的組分。
Fraction of Sample表示樣品組分百分含量，單體所占百分比為84.7%。
Fraction of Protein顯示了樣品中衣殼的百分比，單體包含99.8%的衣殼。這證實了樣本確實是Empty rAAV5。
最后Empty rAAV5樣品總滴度為5.91x10¹³Vp/ml。
 
案例二：
第二個樣品Full rAAV5的三檢測器色譜圖如圖3所示。圖中顯示了與Empty rAAV5截然不同的色譜峰。分析色譜圖可以看出，只包含兩個不同的組分，其中單體峰，大概12.5ml RV處，包含Full 和Empty rAAV5的混合物，而聚集體出現在8ml RV處。測試結果見表2。

對于主體的單體峰，計算出其混合物分子量為4.49×10⁶g/mol，其中86%為衣殼。rAAV5的蛋白質組分的分子量為3.89×10⁶g/mol，這與表1中Empty rAAV5 的數據一致。單體是總體的93.2%，樣本的總滴度為7.48x10¹³VP/ml。其中單體包含78% Full rAAV5，22% Empty rAAV5。需要注意的是，這種分析方法假設樣品要么是Full ，要么是Empty ，忽略部分裝載或過度裝載情況。
Zetasizer Ultra納米粒度及電位儀可以使用MADLS方式快速確定病毒滴度。從OMNISEC獲得的數據與Zetasizer Ultra的粒子滴度進行了比較，兩種技術之間有很好的相關性，見圖4。

另外，本文將Full rAAV5和Empty rAAV5以確定比例混合，來對Full rAAV5樣品進行分析。表3顯示了每個樣品的預期值和實際值Full rAAV百分比。圖5顯示了期望值和實際值之間有很強的相關性，證實了OMNISEC確定樣品實心率結果的可靠性。

為了進一步評估OMNISEC對rAAV樣品準確表征能力，我們進行了rAAV5樣品的熱應力穩定性研究，同時，基于ZS Ultra對聚集體的極高靈敏度，我們利用了ZS Ultra表征rAAV5聚集體的微小變化。測試條件是將rAAV5樣品置于25^oC到80^oC之間進行測試。

在不斷加熱過程中，在每個溫度下測量rAAV5樣品的粒徑。在25^oC和35^oC之間，沒有觀察到粒徑的變化。從35^oC開始，可以觀察到粒徑開始增大，這表明樣品開始發生變化(圖6A)。30^oC和45^oC下的數據比較清楚地顯示了這些樣品之間的大小差異(圖6B)。我們選擇45^oC條件，對OMNISEC進行進一步穩定性研究。
將rAAV5樣品在穩定在45^oC，分別在2min 、5min、10min和15min后，取樣品到OMNISEC上測試。圖7色譜疊加圖顯示樣品發生了明顯的變化，聚集體百分含量增加，單體濃度含量降低。表4顯示M_W在此潛伏期內保持穩定，單體峰中的AAV百分比也保持穩定。

結論：
在這項研究中，我們展示了OMNISEC和Zetasizer Ultra在綜合分析表征rAAV5樣品的能力，以及將兩者聯合使用的應用價值。 
OMNISEC多檢測SEC系統將示差折光檢測器、紫外全波長檢測器、光散射檢測器集成一體化設計，具有更高的靈敏度和準確度，通過一次進樣分析，可提供各種血清型AAV樣品的絕對分子量、衣殼大小、滴度、實心率、聚集體、片段和樣品穩定性等關鍵質量屬性。雖然這些參數中很多都可以使用傳統的生物化學方法來確定，但OMNISEC提供了更為簡單、可靠的方法，正逐漸成為一種表征分析AAV通用的技術工具。