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由于PC通常存在于骨髓中，骨髓是用于評估MM MRD的主要標本來源。外周血也被認為是評估 PC 疾病的合適標本，盡管它在 MM MRD 中的作用還有待確定。一般認為，與其他細胞學(xué)方法相比，流式細胞術(shù)會低估骨髓中PC的比例。Rawstron 等人在他們的研究中證實了這一觀點，他們還明確指出，第一次抽吸的樣本中PC的濃度最高，以后每次抽吸都會明顯下降。雖然通過MFC 檢測對明顯復(fù)發(fā)的MM MRD 樣本的臨床解釋不可能因為血液稀釋而改變，但對于含有極低比例異常漿細胞的 MRD+樣本，這種稀釋可能會引起假陰性。因為高度代表性的骨髓標本對于有效和精確的結(jié)果至關(guān)重要，為了避免由于過度的外周血稀釋造成的采樣偏差，第一次抽吸的骨髓應(yīng)始終用于MRD 評估。

遺憾的是，第一次抽出的骨髓經(jīng)常留給形態(tài)學(xué)或其他病理學(xué)檢查，因此，流式細胞室往往只能得到次優(yōu)標本。ó skarsson JT 等人研究出了一種名為骨髓質(zhì)量指數(shù)（BMQI）的新方法來評估骨髓標本采樣質(zhì)量，通過比較第一次和第二次抽取的骨髓，他們發(fā)現(xiàn)有核紅細胞和髓系前體細胞最能預(yù)測稀釋程度。與第二次相比，首次采樣的標本中這些細胞的比例更高。

需要注意的是，吸出的骨髓細胞可以用 EDTA 或肝素鈉真空管收集，但由于儲存在肝素中時 CD138 信號會減弱，所以 EDTA 比肝素鈉更受歡迎。ACD 不得用于骨髓標本抗凝，因為標本與抗凝劑的比例不是最佳的，會改變PH 值，從而降低細胞的存活率。新抽出的骨髓標本可以補充少量的完全培養(yǎng)基，并應(yīng)在室溫下儲存不超過 48 小時。如果標本在較低溫度下儲存較長時間，CD138 抗原可能會脫落，CD138 強度及變異系數(shù)會大幅增加（如下圖）。骨髓在運輸和儲存過程中應(yīng)嚴格避免溫度過度變化，但室溫運輸已被證實是可以接受的。由于標本年齡是 MFC 分析中的一個關(guān)鍵變量，因此應(yīng)在標本上標注采集日期和時間并盡快處理。多中?臨床試驗采用的標準是從標本采集到染色不超過 24 小時。

此外，標本質(zhì)量受損的證據(jù)包括溶血、凝塊、骨髓稀釋、標本摸起來太冷或太熱，以及存在凋亡的漿細胞（在分析過程中檢測到前向散射和側(cè)向散射光減少）。應(yīng)評估骨髓細胞活率，如果低于 85%，則被認為是 MM MRD 檢測的次優(yōu)選擇。只要樣本的完整性受到影響，就必須在最后的報告中注明觀察結(jié)果。

由于在治療后的骨髓穿刺物中可能存在極少量異常 PC，而且患者細胞濃度基本已經(jīng)恢復(fù)至正常水平，采集到足夠的細胞數(shù)量顯得難能可貴，ICCS（國際臨床流式協(xié)會）推薦使用一管十色方案精確評估 MM MRD，不僅大大節(jié)約了樣本，還避免多管重復(fù)設(shè)門造成技術(shù)成本上升。目前的共識建議使用CD38 和 CD138 設(shè)門圈選 PC，通過表面單克隆抗體 CD19、CD56、CD27、CD81、CD117 以及胞質(zhì)抗 Kappa 和抗 Lambda 多克隆等抗體來精確區(qū)分正常和異常 PC。

開發(fā)或修改目前實驗室的 MM MRD 方案，都應(yīng)該完成方法確認才能進行病人結(jié)果報告。適當驗證每個標記物結(jié)合熒光素的分辨能力，確定抗體性能的方法是將其染色分辨率與方案中使用的所有其他抗體一起評估，而不是單獨使用該抗體，最好是通過染色指數(shù)的計算來實現(xiàn)。除了評估所使用的熒光單抗的染色指數(shù)外，還要優(yōu)化方案設(shè)計，避免選擇的熒光染料有顯著的擴散誤差從而導(dǎo)致相關(guān)通道的分辨率下降。

需要注意的是，隨著針對 MM 細胞表面抗原（如 CD38 單抗等）新藥相繼被用于臨床，這些療法可以阻斷 MM 細胞表面抗原達數(shù)月之久，因此可能對多色流式檢測產(chǎn)生干擾。Darzalex^? (daratumumab)是一種抗 CD38 IgG1kappa 人單克隆抗體，以高親和力與獨特的 CD38 表位結(jié)合，已被證明是治療難治性多發(fā)性骨髓瘤患者的有效藥物。daratumumab 使更多患者獲得 MRD陰性并提高了生存率。由于 CD38 是用于多色流式識別 PC 的關(guān)鍵標識物，因此 daratumumab 的使用會影響 MM MRD 的檢測靈敏度。更不幸的是，另一個主要設(shè)門標識 CD138 可以在 PC 上異質(zhì)性表達，并在不正確的儲存條件和/或細胞老化時從細胞表面脫落。

目前，當 CD38 和/或 CD138 受到影響時，可以考慮替代標識，例如：大多數(shù) PC 表達的 CD54、CD229 和 CD319。然而，這些標記不是 PC 特異性的，所以限制了它們完全取代 CD38 和/或 CD138 來檢測 PC 的可能性；CD269 的表達更具 PC 特異性，但并非所有 PC 都表達此特定標記；EuroFlow 建議使用多表位的CD38-ME 抗體。然而，CD38-ME 抗體在 daratumumab 存在的情況下僅能部分恢復(fù) CD38 的檢測，并且強度仍然減弱，與未經(jīng)處理的樣品相比，熒光強度損失超過 50%；VS38c 是一種能識別內(nèi)質(zhì)網(wǎng) CLIMP-63 蛋白的小鼠mAb，使用 VS38c 是基于假設(shè)腫瘤性 PC 由于分泌能力增強，故以遠高于正常PC 和其他白細胞亞群的水平表達 CLIMP-63。但有研究已經(jīng)表明，雖然 VS38c在大多數(shù) PC 中高度表達，但它也由其他造血細胞表達，包括單核細胞、髓系細胞和 B 細胞亞群。另外，VS38c 需要破膜檢測，對破膜劑要求較高，細胞不進行預(yù)洗滌也會影響結(jié)果（如下圖）。選擇 Perfix-NC 使用一步法對 PC 進行固定破膜和染色，可以有效減少處理步驟繁瑣導(dǎo)致自發(fā)熒光增加，而且大大縮減了樣本制備時間。

目前能夠克服這些克隆的弊端的一種策略是使用 CD38 納米抗體（CD38nano,克隆 JK36）對 PC 進行染色，納米抗體是單可變結(jié)構(gòu)域抗體片段（VHH），通常會暴露較長的互補決定區(qū) 3（CDR3），該特性使抗 CD38nano 能夠識別抗 CD38 療法無法掩蓋的隱秘表位。

目前的共識建議是每管至少采集 2×10E6 個細胞，最好是 5×10E6 個細胞，還建議使用“預(yù)裂解”的染色程序來獲得 MRD 評估所需的大量細胞，同時承認其他染色程序經(jīng)過適當驗證后也可使用。

在“預(yù)裂解”程序中，大量骨髓樣品在染色之前先用大體積裂解液裂解，接著染色標記，在上機之前，再次裂解以去除殘留的紅細胞。但習慣了“染色后裂解”的實驗室使用該方法可能比較難轉(zhuǎn)換過來。此外，兩次裂解可能會影響某些抗原的染色強度（如下圖），或?qū)е履承┐?lián)染料的分解。

另一種替代方法是使用“混合管”方法。這種方法是將骨髓樣本按照常規(guī)程序（先染色后裂解）處理后，最后混在一起增加可獲取的細胞總數(shù)。使用“混合管”方法的優(yōu)點是和實驗室常規(guī)操作步驟一致，更容易接納。此外，該方法只裂解一次，故可更好地保留抗原表達。

另外，自動化的流式樣本制備可以標準化，提升效率和結(jié)果準確性，也是一種值得推薦的方法。流式樣本制備允許一次性移液 400uL 骨髓樣本進行抗體染色，支持“預(yù)裂解”和“染色后裂解”等方法，并可以機載完成細胞預(yù)洗滌、溶血后洗滌和固定破膜等程序。利用流式樣本制備進行MM MRD 樣本制備，結(jié)果表明：相較于免洗方法檢測骨髓 PC，細胞得率并沒有受到樣本預(yù)洗滌和破膜等流程的影響，且 PC 比例沒有明顯變化（如下圖）。

無論如何都不能使用 Ficoll 富集細胞，因為富集過程會導(dǎo)致 PC 的選擇性丟失并影響一些抗原表達（例如 CD138）。

在大多數(shù)臨床實驗室中，MFC 識別骨髓中腫瘤性 PC 的檢測靈敏度范圍為 10E-4（萬分之一）到 10E-6（百萬分之一）。盡管多中心數(shù)據(jù)已證明 0.01%的最低檢測靈敏度對 MRD 評估具有明確的預(yù)后價值，但很明顯，隨著檢測靈敏度的提高，MRD 狀態(tài)與臨床結(jié)果之間的相關(guān)性也在增加。

為了建立測定和/或儀器的檢測靈敏度以從背景中枚舉少量真實 PC，需要建立空白限（LOB）、檢測限（LOD）和定量下限（LLOQ）。

LOB 被定義為在沒有漿細胞的樣本中，MRD 最終設(shè)門區(qū)域能檢測到的背景事件數(shù)量或百分比，因為已知大多數(shù)骨髓至少含有一定水平的漿細胞，所以使用骨髓樣本染上 MM MRD 方案中所有的抗體（除了 CD38 和 CD138 以外），就能完成 LOB 的建立。

LOD 則被定義為可靠地區(qū)分高于 LOB 水平的漿細胞的能力，在此水平，99%以上的具有低水平 PC 的樣品將被檢測出來，其計算方法是 LOB 平均值加上 3 倍 LOB 測量值的標準偏差。

LLOQ 被定義為在某些預(yù)定義的偏倚和不精密度下，可以在LOB以上可重復(fù)檢測到的PC的最低數(shù)量或百分比。臨床普遍認為MRD檢測的不精密度（變異系數(shù)）不應(yīng)超過30%。

其他研究表明，20 個事件是 LOD 理論上的保守閾值。共識指南建議 MMMRD 的 LOD 至少為 0.001%，這意味著最少收集 2×10E6 個事件進行分析。如果采集的細胞數(shù)量少于 200 萬且未檢測到 MRD，則應(yīng)對 LOD 進行說明，并在報告中說明分析靈敏度降低的限定性聲明。同樣，通常使用 50 個事件來表示LLOQ 閾值，因此，總事件數(shù)為 5×10E6 才能達到 0.001%的 LLOQ。盡管如此，根據(jù)美國病理學(xué)家學(xué)會的建議，每個實驗室都應(yīng)憑經(jīng)驗確認其 LOD 和 LLOQ。LLOQ 的最佳確定方法是，使用接近 LOD 的至少三種不同濃度樣品重復(fù) 3-5 次對異常 PC 進行計數(shù)。確定 LLOQ 的一種實用方法是將患有漿細胞疾病的骨髓樣本按照 MM MRD 方案進行全染色，用部分染色的健康樣本進行連續(xù)倍比稀釋，得到低濃度樣本。

MRD 數(shù)據(jù)的分析在很大程度上取決于分析人員定義正常與異常 PC 的專業(yè)知識水平。作為標準做法，理想的數(shù)據(jù)分析工作流程應(yīng)從 Time 參數(shù)開始，以排除無效事件，例如氣泡或堵塞。FSC-A、W、H 的組合用于排除粘連體。但是，在評估 PC 時應(yīng)格外小心，因為它們的 FSC 和 SSC 可能很難固定，不同患者之間可能相差很大。Sidana 及其同事在一項前瞻性研究中表明，根據(jù)流式細胞術(shù)評估，275 名新診斷的 MM 患者中有 17 名（6%）是四倍體，這些四倍體群體通常表現(xiàn)出高于正常細胞群體的異常光散射特征，由于其較高的散射光信號，這些細胞很可能落入散點圖的“粘連體”區(qū)域。出于這個原因，當使用前向和側(cè)向散射光信號來排除粘連體時，應(yīng)注意不要排除這個群體。圈出總漿細胞的完整設(shè)門策略見下圖：

如果漿細胞表達異常抗原或者表現(xiàn)出正常抗原的表達水平增加或減少，則通常認為漿細胞是異常的。目前的共識是用 CD38、CD138、CD45 和光散射特征的組合識別 PC，為了準確區(qū)分骨髓瘤細胞與正常 PC，方案中應(yīng)包括CD38、CD45、CD19、CD56、CD81、CD117 和胞內(nèi)輕鏈。正常 PC 通常表達為 CD38bright、CD45+、CD19+、CD56?、CD27bright、CD81bright 和 CD117?且無輕鏈限制性。異常 PC 通常會有 2 個或更多標識的異常表達。例如，腫瘤PC 出現(xiàn) CD38 減弱和 CD45 缺失，CD19-、CD56+/bright、CD27dim、CD81dim 和輕鏈限制性表達可用于識別異常 PC。

由于流式 MM MRD 檢測已成為確定新療法療效和患者反應(yīng)深度的重要方法，因此需要一種共識方法，以便可以解釋獨立實驗室之間的測試結(jié)果可重復(fù)性和意義。2013 年對美國實驗室進行骨髓瘤流式 MRD 的一項調(diào)查表明，流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)分析缺乏標準化方法導(dǎo)致 MM MRD 分析和解釋存在重大差異。從那時起，一系列努力使這些方面標準化，例如，英國國家外部質(zhì)量評估服務(wù)中心（UK NEQAS）最近倡導(dǎo)了一個外部質(zhì)量評估計劃，該計劃評估了流式細胞術(shù)檢測 MM MRD 的可重復(fù)性。在這項研究中，將含有 0%、0.1%、0.01%、0.001%和 0.0001%的5個稀釋系列的骨髓樣本分發(fā)給 10 個國際實驗室，其中 8 個實驗室提交了答復(fù)。這些實驗室被要求使用他們自己實驗室建立的程序?qū)毎M行染色，并根據(jù) MM MRD 測試的樣本染色、采集、分析和報告的共識指南對骨髓瘤細胞進行定量評估。總體而言，該研究證明了低至0.001%的 MRD 水平還存在良好的檢測線性，8個實驗室中有6個檢測到腫瘤PC 的最低限水平為0.0001%。然而，在方案設(shè)計、熒光染料偶聯(lián)物和使用的裂解試劑中發(fā)現(xiàn)了偏差。該研究得出的結(jié)論是，如果MFC對MM MRD的評估進一步標準化，也可以減少實驗室間的差異。