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摘 要：

  USP 787和USP788描述了治療用蛋白質和醫用注射液中怎樣測量肉眼不可見的顆粒物。大部分這類藥物是通過預充式注射器進行包裝。這些注射器里都有硅油，因為硅油可以降低注射藥物時注射器的阻力。這些硅油形成的乳滴在用顯微鏡方法進行計數統計的時候會造成一定的誤差。本文主要通過使用AccuSizer 780SIS研究這些硅油滴在蛋白質注射液計數方面的影響。

簡 介：

 注射藥物顆粒物的檢測主要包括肉眼可見和不可見兩個方面。對于肉眼不可見的檢測主要是通過液體顆粒計數或者顯微鏡兩種方法來完成。后文中提到的檢測過濾前后的粒子數量，主要是為了排除由于注射器中螺帽，機筒和活塞本身帶來的額外的粒子影響。盡管和纖維，金屬碎片等外來污染物相比，注射器中這些硅油粒所造成的安全危害較小，但是他們也可以通過液體顆粒計數來監測。并且預充式注射器內部的硅油乳粒會帶來大量不同大小的顆粒。

材料介紹：

   注射器：實驗中用到的注射器是來自 BD PosiFlush Normal Saline Syringe, 10 mL, Ref no. 306546 如圖1.硅潤滑油：醫用的硅潤滑油應用到注射器的螺帽，機筒和內壁，使得注射器可以更好的推動。

   本文測量了鹽水和鹽水與蛋白質混合后在注射器中顆粒的變化。

   蛋白質：Athens Research & Technology, Immunoglobin G, Human Plasma, Lot no. IG2014-02, Cat no. 16-16-090707, lyophilized（凍干） from 22.4 mL 20 mM phosphate buffer（磷酸鹽緩沖液）, pH 7.4, w/ 150 mM NaCal & 0.05% sodium azide（疊氮化鈉）.蛋白質在PBS(聚丁二酸丁二醇酯)中進行分散;磷酸鹽緩沖藥品，Sigma Aldrich P4417-50TAB。

方法學：

 首先通過對注射器的粒子進行測量，沒有進行過任何以下激活處理包括沒有插入AccuSizer的樣品管或者沒有移除機筒并將其倒入一個干凈的燒杯或者推動活塞進入一個干凈的燒杯。

   lgG蛋白用過濾的PBS溶液配成0.1mg/ml的溶液。用移液槍取0.5ml的溶液加入到包含過濾后的PBS溶液和食鹽水中的10ml注射器中。使用AccuSizer儀器取1ml的樣品不稀釋直接測量，重復測三次檢查重復性。

檢測儀器：

     AccuSizer FX Nano SIS 儀器擁有兩個傳感器LE-400;0.5μm-100μm和FX Nano;0.15μm-10μm，如圖2所示。AccuSizer SIS取樣器可將進樣量準確的下調至100μl。AccuSizer FX Nano SIS是僅有一個注射進樣器和兩個傳感器，并沒有增加檢測器或者電腦的數量。

結果討論：

   從24個注射器中隨機的選擇了8個注射器。其中4個用只有LE400的傳感器進行分析同時沒有推動活塞，具體結果如圖3所示，另外四個則將通過活塞將樣品推到一個干凈的燒杯中，如圖4所示。橫坐標X用來表示粒子的大小，縱坐標表示粒子的濃度 粒子數量/ml。

討 論：

   實驗設計的目的是期望通過推動活塞進入到燒杯中會因為硅油乳粒的存在而使得顆粒濃度有一定的增加。兩個沒有激活的樣品在圖標3可以看出大于0.5μm的粒子濃度約為10,000個/ml，另外的兩個大于0.5μm的粒子濃度在20,000個/ml。激活的四個樣品大于0.5μm的粒子濃度大約在16,000個/ml和28,000個/ml。說明注射器中硅油的存在會增加。

蛋白質的測量結果：

      USP787是用來描述治療用蛋白質，同時USP788對于理想結果的判定通過標準是10μm和25μm，但是FDA建議檢測更小的蛋白質粒子，這樣才能給出更好的標準關于檢測蛋白質聚集的標準。

   三個激活的鹽水的樣品和分散在PBS里的lgG蛋白樣品通過包含兩個傳感器的AccuSizer FX Nano SIS進行測量，結果如圖5和圖6。之后這蛋白質被過濾后額PBS（blue）：鹽水=2：1的混合液進行稀釋，具體結果如圖7。

討 論：

   可以從圖5看出，注射器和注射器中由于硅油滴的存在引起的粒子數量的變化在更小的范圍被發現。同時說明不同的注射器里硅油所造成的粒子數目也有區別。

   AccuSizer 780 FX Nano SIS儀器可以對0.2μm-0.5μm的粒子進行計數，因為它的檢測下限可以降到0.15μm。這種新的對于小粒子的敏感性的技術正在尋找其他領域的應用，它可以很好的應用到蛋白質的檢測中了，如圖6所示的蛋白質分散在過濾后的PBS溶液和圖7所示的蛋白質和鹽水混合的溶液。可以明顯的區分出在鹽水和蛋白質溶液中的粒子大小和數目。

結 論：

      AccuSizer 780 FX Nano SIS符合所有關于USP787和788的檢測要求。同時對于分析不可見的粒子是最好的選擇，因為它的檢測下線可以精確到0.15μm，最小的檢測樣品量可以低到100μl。這種低量程的計數工具為實驗提供更多有趣的結果，特別是可以幫助研發人員更好的在研究治療和注射用的蛋白質聚集的問題。這種獨特的技術為AccuSizer 780 FX Nano SIS提供了其他顆粒檢測儀器所不具備的能力。它不僅是一個液體顆粒計數器還是一個粒度儀。

參考文獻：

1. USP 787, Subvisible particulate matter in therapeutic protein injections;

2. USP 788, Particulate matter in injections;

3. PSS Application：Protein Aggregation, available at www.pssnicomp.cn .